Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.

Komentováno: 29. 5. 2013

TALENs are important new tools for genome engineering. Fusions of transcription activator-like (TAL) effectors of plant pathogenic Xanthomonas spp. to the FokI nuclease, TALENs bind and cleave DNA in pairs. Binding specificity is determined by customizable arrays of polymorphic amino acid repeats in the TAL effectors. We present a method and reagents for efficiently assembling TALEN constructs with custom repeat arrays. We also describe design guidelines based on naturally occurring TAL effectors and their binding sites. Using software that applies these guidelines, in nine genes from plants, animals and protists, we found candidate cleavage sites on average every 35 bp. Each of 15 sites selected from this set was cleaved in a yeast-based assay with TALEN pairs constructed with our reagents. We used two of the TALEN pairs to mutate HPRT1 in human cells and ADH1 in Arabidopsis thaliana protoplasts. Our reagents include a plasmid construct for making custom TAL effectors and one for TAL effector fusions to additional proteins of interest. Using the former, we constructed de novo a functional analog of AvrHah1 of Xanthomonas gardneri. The complete plasmid set is available through the non-profit repository AddGene and a web-based version of our software is freely accessible online.

Nucleic Acids Res. 2011 Jul;39(12):e82.



Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.: Práce prakticky představuje návod, podle kterého lze provádět genetické modifikace a to jak „knock-out“ tak i „knock-in“ jakéhokoli genu. Využívají se tzv. TAL efektory, jedná se o proteiny specificky se vázající na DNA, se kterými je konjugovaná FokI nukleáza. V principu si lze na základě cílové sekvence jednoduše připravit vhodné TAL-efektory, které se specificky naváží na cílovou sekvenci a FokI nukleáza cílovou sekvenci rozštěpí. DNA dvouřetězcové zlomy jsou následně v buňce opravovány pomocí NHEJ, přičemž velmi často dochází ke vzniku malých inzercí nebo delecí, což v konečném důsledku vede k tomu, že vzniká mutovaný, většinou nefunkční protein.




Registrace Přihlášení

Přihlášení